Nhóm thiết bị có tác dụng lạnhNhóm thiết bị làm cho nóngNhóm thiết bị cơ họcNội thất chống thí nghiệmCân/pH/Lọc/Pipet/Bơm...
Bạn đang xem: Điện di là gì
Hóa hóa học cơ bản/phân tíchHóa chất sinh họcSinh phẩm xét nghiệmPipet/Vật tứ tiêu haoHóa chất sinh học tập phân tử
Các kỹ thuật phân tíchCác kỹ thuật rước mẫuPhân loại môi trườngCác dự án môi trường - chuyển giao công nghệMôi trường với cuộc sống
amiralmomenin.net
1. Nguyên tắc cơ bản
Điện di là quá trình di chuyển của phân tử tích năng lượng điện trong dung dịch dưới chức năng của điện trường. Điện di thường được phân loại phụ thuộc vào sựcó mặthoặc vắng mặt của môi trường xung quanh hoặc chất nềnrắn chỗ màphân tử tích điện dịch chuyển. Khối hệ thống điện di dung dịch thực hiện hệđệm dung dịch cụ cho môi trường thiên nhiên rắn, những hệ thống như vậy rất có thể chịu ảnh hưởng bởi sự xáo trộn mẫu mã do bao gồm sự khuếch tán của phân tử tích điện, có tác dụng giảm độ phân giải trong quy trình ứng dụng, phân tách và quá trình loại quăng quật mẫu. Như vậy khối hệ thống điện di dung dịch phải sử dụng một vài phương tiện nhằm mục tiêu ổn định dung dịch trong tế bào điện di. Ví dụ: khối hệ thống điện di độ chênh hòa tan sử dụng những chất tan không tồn tại ion với mật độ không giống nhau (Vd: Đường sucrose hoặc glycerol) để sút thiểu độ khuếch tán của vật hóa học được bóc tách ra trong quy trình điện di như Hình 1. Nhưng ngay cả cónhững đổi mới thì hệ thống phân bóc điện di vẫn còn đó hạn chế đó là khi sử dụng cho việc sẵn sàng tỷ lệ xích vật hóa học (preparative scale: preparative là 1 từ về tối nghĩa, trong công nghệ sinh học nó tức là việc cô lập vài mili gram vật hóa học cho câu hỏi đánh giá hoạt động sinh lý học của nó) bởi phân tách điện di.
Hình 1: hệ thống điện di dung dịch.
Ứng dụng thiết thực độc nhất của phương thức điện di trong technology hóa sinh là năng lượng điện di vùng (zonal electrophoresis), trong đó dung dịch ion gồm vai trò như 1 khuôn đỡ rắn và mẫu sẽ tiến hành đưa vào dưới dạng điểm hoặc băng đồ dùng chất. Giấy năng lượng điện di, dải cellulose acetate, dải cellulose nitrate với gel năng lượng điện di là đông đảo thành phần của khối hệ thống điện di (Hình 2). Những hệ thống này thông thông thường được áp dụng cho so với hơn là việc chuẩn bị tỷ lệ xích vật hóa học (preparative scale).
Hình 2: Hai hệ thống điện di vùng (zonal electrophoresis).
Tất cả các dạng của hệ thống điện di đông đảo tuân theo quy lý lẽ như vào phương trình (*) sau đây:
(*) Độ linh động của phân tử =
Độ năng động hoặc tốc độ chuyển động của phân tử tạo thêm khi hiệu điện thay và điện tích của phân tử tăng thêm và ngược lại độ biến hóa năng động giảm khi ma ngay cạnh giữa các phân tử hoặc độ nhớt của môi trường tăng làm cản trở loại chảy. Tổng hoạt động thực tế của những phân tử tăng nhiều theo thời gian chính vì như vậy độ linh động được tư tưởng là tốc độ của sự di chuyển, phương trình (*) là phương trình cực kì quan trọng trong ngành hóa sinh thực nghiệm. Tất cả các khối hệ thống điện di đều áp dụng một hiệu điện thếbằng nhau với không thay đổi trên toàn bộ tiết diện cắt theo đường ngang của dải giấy, gel hay dung dịch dùng trong phân bóc tách điện di. Đơn vị của điện trường là V/cm (độ to của nó được xác minh bằng quý giá của năng lượng điện áp), với theo định lý lẽ Ohm (V = IR) ta gồm điện áp V là hàm của loại điện I cùng điện trở R, điện trở của khối hệ thống được đưa ra quyết định bởi bản chất của thiết bị năng lượng điện di cùng thành phần bộ đệm. Cho nên vì vậy dòng năng lượng điện (vd: mA) hay được dùng làm xác định yêu cầu về hiệu điện thếcủa phép phân tách bóc điện di. Điện trở của hệ thống là nhân tố rất đặc biệt quan trọng vì nó sẽ quyết định lượng nhiệt hiện ra trong quy trình điện di. Khi mà độ năng động điện di cũng phụ thuộc vào nhiệt độ độ cho nên vì vậy nhiệt độ của hóa học nền phân tách phải được điều khiển. Nếu một lượng nhiệt đầy đủ lớn xuất hiện thêm trong quá trình điện di thì yêu thương cầu khối hệ thống phải có một trong những thiết bị làm cho mát để gia hạn được ánh sáng không thay đổi trong suốt quá trình làm việc. Các quy mô “smiling” thường thấy trên phiến gel năng lượng điện di là công dụng của sự gia nhiệt không đồng dạng của nó.
Nếu điện áp hoặc loại điện được cung cấp cho khối hệ thống điện di là không thay đổi trong suốt quy trình phân bóc tách điện di thì độ năng động của phân tử sẽ nhờ vào vào những thành phần là dòng điện tích với tính ma liền kề của phân tử vào mẫu. Xét quá trình phân bóc điện di trên chứng từ của acid glutamine, este methyl asaparagine với glycinamide tại quý hiếm pH 6.0. Điện tích và cân nặng phân tử của các hợp hóa học được thể hiện trong Hình 3.
Hình 3: Phân bóc tách bằng năng lượng điện di giấy của acidglutamic, glutamine, asparagine, methyl ester vàglycinamide tại pH 6.0. Glycinamide, có điện tích +1 và trọng lượng phân tử là 75 rất có thể không nhất thiết dịch chuyển nhanh gấp hai lần vớiasparagine methyl ester tất cả cùng điện tích nhưng tất cả kích thước gấp rất nhiều lần lần. Đặc biệt, tínhchất của đệm tất cả thể ảnh hưởng đến sự phân bố độ ma sát của những phân tử nhỏ. Lực ion cao hơn có thể làm sút sự phân bổ ma sát.
Ta thấy những acid amin cùng kích thước và este methyl asparagine được phân tách tuân theo hàm về điện tích của bọn chúng ở cực hiếm pH 6.0 trong những khi glycinamite (có thuộc điện tích nhưng kích cỡ chỉ bằng nửa so với este methyl asparagines) lại dịch rời xa hơn về phía rất âm (-) của hệ thống.
Nói thông thường các nguyên lý được minh họa vào Hình 3 rất có thể được áp dụng để minh họa tính biến hóa năng động của phân tử ion kích thước nhỏ. Các nguyên lý này đặc biệt quan trọng hữu ích cho bài toán tiên đoán khả năng phân bóc điện di của những phân tử nhỏ dại chứa các nhóm tất cả tính acid hoặc bazơ yếu, những phân tử này chỉ với theo một phần điện tích trung bình trong dải pH liên quan đến phép chuẩn chỉnh của chúng, lấy ví dụ trong phân tách điện di của các nucleotide hoặc những acid amin.
Sự phân bóc điện di của những phân tử to hơn các đại phân tử tuân theo nguyên tắc của phương trình (*) nhưng các yếu tố khác sẽ ảnh hưởng đến độ phân giải của những đại phân tử. Độ ma giáp của phân tử trong thừa trình di chuyển điện di bị tác động bởi cả nhì yếu tố là hình dạng và size của phân tử. Nếu quy trình điện di được thực hiện trong một môi trường thiên nhiên có các rào cản có tính năng cản trở đáng chú ý sự chuyển động của những đại phân tử thông qua nó (ví dụ như hai khối hệ thống thường được sử dụng là polyacrylamide với agarose) bây giờ kích thước phân tử được minh chứng là yếu đuối tố đặc biệt nhất quyết định tính năng động của nó. Nếu xác suất điện tích/khối lượng của đại phân tử được phân tách là xấp xỉ giống hệt thì kích thước của phân tử là nguyên tố duy nhất tác động đến tính cầm tay điện di. Những đk này đang rất được sử dụng nhằm xác định khối lượng phân tử của đái phần protein bằng cách thức điện di bên trên gel polyacrylamide gồm chứa natri dodecyl sunphát (SDS-PAGE), và trong phân bóc tách điện di của những thang oligonucleotide trong quy trình giải trình trường đoản cú ADN. Đối cùng với phân tử cỡ nhỏ tuổi có các liên kết có thể xoay trường đoản cú do, cho nên hình dạng phân tử không tác động nhiều đến ma sát, yêu cầu điềuquyết định thiết yếu đến độ ma gần cạnh là size của phân tử. Mặc dù các đại phân tử thường có hình dạng khẳng định với tỷ lệ rõ ràng của những trục (ví dụ phần trăm chiều lâu năm với chiều rộng) công dụng là cả mẫu thiết kế và size đều ảnh hưởng tới sự dịch rời của phân tử. Phân tử có xác suất lớn giữa những trục (hình dạng thuôn dài) diễn tả tính linh động trong quy trình điện di thấp hơn so cùng với phân tử hình dáng cầu bao gồm điện tích và cân nặng bằng nhau. Ngoài ra các đại phân tử có tính năng động không giống như với nguyên lý điện di tự phương trình (*) chính vì sự hệ trọng của nó với các ion hoặc vày sự dựa vào của điện tích vào sự liên kết của những nội phân tử.
2. Những dạng đặc trưng của năng lượng điện di thường được thực hiện trong technology sinh học
– Điện di giấy ( Paper Electrophoresis):Điện di trên giấy tờ là phương thức điện di thường xuyên được thực hiện để phân tích với phân giải các phân tử khuôn khổ nhỏ. Phương pháp này không được áp dụng để phân giải các đại phân tử (ví dụ protein…) bởi vì sự hấp thụ và sức căng bề mặt liên kết cùng với giấy năng lượng điện di thường làm biến hóa hoặc biến chuyển tính những đại phân tử chế tạo ra ra độ sắc nét kém.
Có hai phương thức điện di giấy.
Đối với quá trình khô, chủng loại của chất tan được phối hợp trong nước hoặc một bộ đệm dễ cất cánh hơi tiếp nối nó được nhỏ một giọt nhỏ tuổi hoặc sọc mỏng manh lên đường cội (origin line) hoặc đường chì (pencil line) trên giấy, tiếp nối các hợp chất tiêu chuẩn chỉnh thích đúng theo đã hiểu rằng đưa vào các vị trí khác trên đường gốc của giấy. Nếu như bạn dự đoán được rằng sự di chuyển điện di vẫn về cả nhì phía điện rất của khối hệ thống thì mặt đường gốc nên đặt tại vai trung phong của giấy, còn giả dụ sự dịch chuyển điện di chỉ theo 1 phía điện rất thì mặt đường gốc nên đặt tại ngay sát một đầu (rìa) của giấy. Sau thời điểm dung môi hòa tan có chứa các mẫu đã bay hơi hết, giấy được làm ẩm với đệm năng lượng điện di bằng phương pháp phun đồng nhất hoặc ngâm thấm các đầu của tờ giấy để triển khai ẩm cả 2 đầu với đường nơi bắt đầu của nó.Quy trình ướt, mẫu dung dịch cô đặc trong nước đựng được nhỏ dại lên trên giấy trước khi được gia công ẩm với đệm điện di. Quá trình khô hữu ích thế so với tiến trình ướt kia là được cho phép điểm mẫu lúc đầu nhỏ và độ phân giải tốt hơn đối với những hợp chất bao gồm cùng độ linh động. Tuy nhiên quy trình khô khá phiền toái bởi vì việc nhúng cùng phun yên cầu kỹ năng làm việc để ngăn việc làm dây mẫu ra ngoài. Các bước ướt đơn giản và dễ dàng hơn nhiều nhưng giọt mẫu mã điểm thường to hơn và độ sắc nét thu được yếu hơn vì chưng sự khuếch tán của mẫu.Sau khi mẫu mã được để lên trên mảnh giấy ẩm, giấy này được gửi vào phòng điện di để cho cả hai đầu của giấy đều tiếp xúc cùng với bình chứa bộ đệm năng lượng điện di và những điện cực (Hình 4). Ví như đường nơi bắt đầu không nằm ở vị trí tâm của tờ giấy thì tờ giấy phải được định vị sao cho có thể được cho phép tối nhiều sự dịch rời về phía điện cực ý muốn muốn. Tiếp đến buồng điện di được đóng góp lại để ngăn sốc điện với điện trường sẽ tiến hành cấp mang lại hệ thống.
Dưới tính năng của điện trường và điện trở lên loại điện, cỗ đệm giấy sinh ra nhiệt, đấy là vấn đề to và trở ngại nhất đối với phương pháp điện di bên trên giấy bởi vì nhiệt hình thành có chức năng sấy khô giấy có tác dụng cản trở chiếc điện và hiệu quả làm đến điện trở lại tăng lên v.v. Tất cả nếu ta rất có thể ngăn chặn quá trình bị sấy thô của giấy vày nhiệt thì lượng nhiệt có mặt này vẫn làm đổi khác tính chất mẫu điện cùng trở chống của hệ thống làm biến dị sự di chuyển của phân tử.
Hình 4: Hai khối hệ thống điện di giấy.
Bởi bởi vì những trở ngại trên bắt buộc các hệ thống điện di bên trên giấy tiến bộ đã được thiết kế với để khắc chế những sự việc về sức nóng lượng sinh ra. Phần nhiều các thiết bị áp dụng điện áp thấp được thiết kế với dưới dạng nhỏ dại gọn cơ đụng và nó rất có thể được quản lý và vận hành trong phòng giá hoặc trong phòng đông lạnh. Ngược lại các thiết bị áp dụng điện áp cao hay sử dụng hệ thống làm non dạng giường phẳng lì hoặc được vận hành trong một bồn làm mát đựng dung môi trơ với không phân rất (ví dụ: Varso-một sản phẩm từ chưng chứa dầu mỏ). Dung nhờn này hấp thụ nhiệt độ tỏa ra từ hệ thống mà không cần trộn cùng với nước, cỗ đệm hoặc các mẫu trên chứng từ (Hình 4). Sau khoản thời gian điện di các mẫu trên chứng từ với thời hạn và năng lượng điện áp yêu cầu cho việc phân tách tối ưu, chiếc điện sẽ được ngắt, giấy được lấy ra khỏi khối hệ thống và được sấy khô tiếp nối ta có thể xác định được sự hiện diện và vị trí của những phân tử cần quan tâm.
– Điện di mao cai quản (Capillary Electrophoresis):Đây là một phương thức mới cho sự phân tích năng lượng điện di với có áp dụng ngày càng nhiều trong phân tích sinh hóa.
Tên của cách thức đã hỗ trợ chúng ta phần như thế nào đoán được nguyên lý buổi giao lưu của nó, trong các số đó vật hóa học được so sánh và môi trường điện di được để trong một ống mao dẫn mịn, lâu năm (thông thường lâu năm từ 50 mang đến 100cm và 2 lần bán kính trong từ 15 cho 100 μm). Một lượng mẫu rất nhỏ dại (cỡ nano lít) được đặt ở một đầu của ống mao dẫn và chịu đựng sự điện di bên dưới trường tạo bởi vì điện áp từ đôi mươi đến 30kV. Chất phân tích sẽ tiến hành phân bóc tuân theo nguyên tắc của phương trình (*) cùng được phát hiện nay khi chúng mở ra ở đều vị trí kia của ống mao dẫn thường thì là bằng cách thức sắc kí lỏng hiệu năng cao. Ưu điểm của điện di mao dẫn là nó cho độ phân giải cực cao, tốc độ và độ tinh tế cao so với việc phân tích các mẫu rất bé dại nhưng rõ ràng nó không thực sự hữu ích trong phương thức chuẩn bị vật tư (preparative). Nó thường áp dụng trong việc phân tách các phân tử ADN tất cả kích thước không giống nhau chỉ một nucleotit đơn lẻ. Bởi vì phương pháp điện di mao dẫn có độ phân giải rất cao, nên nó là đại lý để phân bóc các polynucleotide trong trình từ ADN kiểu dáng mới. Cách thức điện di mao dẫn cũng tương xứng với sự phân tách bóc các phân tử ko tích điện bằng phương pháp thêm các vi phân tử tích năng lượng điện vào trong môi trường xung quanh dung dịch điện di. Nếu hỗn hợp dung dịch tổng hợp được ngăn cách giữa môi trường thiên nhiên nước và phần kỵ nước bên phía trong của vi hạt được đưa vào trong khối hệ thống này thì chúng hoàn toàn có thể được phân tách bằng phương pháp điện di. Điện di mao dẫn là một cách thức có tính biến hóa năng động cao, phạm vi vận dụng và cách thức tối ưu hóa mang đến nó vẫn đang rất được nghiên cứu.
– Điện di trên gel ( Gel Electrophoresis):Đối với cách thức điện di trên gel, phân tử được phân tách trong hệ đệm lỏng được cung ứng trong một hóa học nền polime. Khối hệ thống điện di trên gel có một số điểm mạnh rõ rệt. Đầu tiên, chúng rất có thể thích hợp trên các mẫu lớn hơn so với phần đông các hệ thống điện di giấy, và cũng rất có thể sử dụng đến việc chuẩn bị tỷ lệ xích (preparative scale) cho những đại phân tử. Vật dụng hai là đặc điểm của chất nền gel bao gồm thể đổi khác theo ý ao ước để cân xứng với những ứng dụng cụ thể, bởi vì gel làm tăng mức độ ma gần kề và điều chỉnh sự năng động điện di (xem phương trình (*)). Vật dụng liệu để triển khai chất nền gồm nồng độ thấp hoặc là mức độ thấp các liên kết chéo cánh của các monomer trong khối hệ thống gel có thể được sử dụng rộng thoải mái như một thiết bị định hình hoặc vứt bỏ đối lưu với sự cản trở kha khá thấp của ma ngay cạnh lên sự chuyển động của những đại phân tử. Vật tư có nồng độ dài hoặc tỷ lệ các liên kết chéo của những monomer to được thực hiện để chế tác ma sát sử dụng trong việc sàng thanh lọc phân tử. Sàng lọc phân tử là trường hợp trong kia độ biến hóa năng động điện di và sự dịch chuyển của dung dịch được khẳng định chủ yếu thông qua độ nhớt và form size lỗ rỗng, hiệu quả là sự dịch rời của các đại phân tử trong khối hệ thống sẽ cơ bản được xác định bởi cân nặng phân tử của chúng.
Rất các tác nhân dạng gel sẽ được áp dụng trong hệ thống điện di, trong số ấy gel agarose (polymer polygalactose) được thực hiện khá phổ biến, nhất là trong vận dụng với rất nhiều đa phân tử như acid nucleic, lipoprotein v.v. Gel polyacrylamide là một trong những tác nhân có ích và linh hoạt nhất sử dụng trong phân bóc điện di cũng chính vì nó dễ dàng giải quyết một loạt những protein cùng acid nucleic (bảng 4-1 cùng 4-2 giải đáp cách sẵn sàng gel SDS-PAGE với gel polyacrylamide mang đến mẫu acid nucleic có trọng lượng phân tử nhỏ).
Gel polyacrylamide được có mặt từ quy trình polymer hóa acryamide (đơn phân tử) cùng N,N&-methylene-bis-acrylamide (liên kết chéo) (Hình 5).
Hình 5: thông số kỹ thuật gel polyacrylamide.
Acrylamide đơn phân tử và dạng liên kết chéo tự bạn dạng thân nó tồn tại sinh sống trạng thái bền hoặc được trộn ngơi nghỉ trong dung dịch, tuy nhiên polymer tiện lợi xuất hiện trong khối hệ thống tạo cội tự do. Các nhà hóa sinh áp dụng các bắt đầu tự vị hóa học hoặc hóa quang để chế tạo ra ra quá trình polymer hóa. Đối với phương pháp hóa học tập (phương pháp được sử dụng thịnh hành nhất) chất khởi tạo nên gốc tự do thoải mái là amoni persulfate (APS) được tiếp tế cùng với chất xúc tác N,N,N&,N&-tetramethylethylenediamine (TEMED). Hai thành phần nêu trên cùng với đơn phân tử, yếu tố liên kết chéo và hệ đệm tương xứng sẽ chế tạo thành gốc tự do tương thích để tạo sự polymer hóa. Đối với quy trình quang hóa (ít được thực hiện hơn), amoni persulfate được thay thế bởi nhân tố nhạy tia nắng (ví dụ riboflavin) để tạo ra gốc tự do thoải mái khi nó bị chiếu bằng tia cực tím. Tất cả thể biến đổi để tạo nên loại gel sử dụng phù hợp với từng ứng dụng. Nếu ứng dụng yêu ước lỗ có kích thước lớn bạn cũng có thể giảm lượng đơn phân tử hoặc (và) liên kết chéo trong dung dịch, ngược lại hoàn toàn có thể tăng nồng độ của 1-1 phân tử hoặc liên kết chéo cánh (hoặc cả hai) để giảm size lỗ.
Yêu mong về kích cỡ lỗ đến từng quá trình phân tách điện di ví dụ sẽ phụ thuộc vào kích cỡ không giống nhau của hợp chất mà các bạn sẽ xử lý. Ví dụ, nếu bạn có nhu cầu xử lý nhị protein cỡ nhỏ tuổi có form size 8000 Da cùng 6000 domain authority thì bạn cần phải có nhiều loại gel với form size lỗ nhỏ tuổi (15 mang đến 20% acrylamide) nhưng nhiều loại gel này sẽ không cho độ phân giải đối với nhì protein to hơn với kích thước 150000 Da với 130000 Da, trong trường đúng theo này ta phải sử dụng loại gel có form size lỗ to hơn (với độ đậm đặc acrylamide tự 7.5 mang đến 10%). Bảng 1chỉ ra phạm vi phân tách bóc protein hiệu quả của gel cùng với các phần trăm acrylamide không giống nhau.
Xem thêm: Viết Phương Trình Mặt Phẳng Chứa Đường Thẳng Và Vuông Góc Với Mặt Phẳng
Bảng 1:Hiệu quả phân tách bóc của gel polyacrylamide ở các nồng độ khác nhau đối với việc sử dụng SDS-PAGE
(còn tiếp)
Tài liệu tham khảo:
Robert L. Switzer,Liam F. Garrity(1999),Experimental Biochemistrythird edition,ISBN-13: 978-0716733003, New York.